Penelitian mengenai limbal stem cells (LSCs) yang berasal dari sel punca pluripoten manusia (hPSC) telah menjadi salah satu topik krusial dalam pengembangan terapi regeneratif untuk gangguan permukaan mata. LSCs berperan vital dalam menjaga homeostasis epitel kornea melalui kemampuan diferensiasinya menjadi sel-sel epitel kornea yang berfungsi optimal. Namun, keterbatasan dalam memahami identitas spesifik, jalur perkembangan, dan dinamika diferensiasi LSCs telah menghambat pengembangan protokol diferensiasi yang efisien serta penerapannya dalam klinis.
Teknologi sequencing RNA sel tunggal (scRNA-seq) telah membuka jalan baru untuk memahami dinamika transkriptomik pada tingkat sel tunggal selama proses diferensiasi LSCs. Dengan kemampuan untuk menganalisis ekspresi gen secara individual dalam populasi sel yang heterogen, scRNA-seq memungkinkan pemetaan jalur perkembangan sel serta identifikasi subpopulasi yang mungkin luput dalam analisis berbasis bulk RNA. Studi oleh Sun et al. (2021) menggunakan pendekatan scRNA-seq untuk mengkaji dinamika ekspresi gen pada LSCs yang diturunkan dari human embryonic stem cells (hESCs). Penelitian ini memetakan perubahan transkripsional pada empat titik waktu berbeda: hari 0 (sebelum induksi), hari ke-7, ke-14, dan ke-21 selama proses diferensiasi in vitro.
Hasil analisis menunjukkan bahwa meskipun protokol diferensiasi yang digunakan mampu menghasilkan populasi LSCs, terdapat heterogenitas yang signifikan dalam ekspresi penanda LSC yang telah dikenal, seperti TP63, KRT14, dan ABCG2. Pada hari ke-7, hanya sekitar 6,03% sel yang mengekspresikan TP63, angka yang meningkat menjadi 11,21% pada hari ke-14 tetapi kemudian turun drastis menjadi 2,46% pada hari ke-21. Variasi ini menunjukkan bahwa populasi sel yang dihasilkan tidak seragam, mengindikasikan perlunya optimasi lebih lanjut dalam protokol diferensiasi.
Dalam analisis jalur perkembangan sel (pseudotime trajectory), ditemukan bahwa proses diferensiasi hESCs menuju LSCs mengalami percabangan menjadi tiga jalur utama. Jalur pertama mengarah pada pembentukan sel mesenkimal yang menunjukkan aktivasi program epithelial-mesenchymal transition (EMT). Jalur kedua melibatkan sel-sel yang mengalami apoptosis, sementara jalur ketiga merupakan jalur utama yang mengarah pada diferensiasi LSCs dan progeninya. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahwa peningkatan ekspresi penanda LSC seperti KRT19, ABCG2, dan TP63 terjadi secara progresif pada jalur ketiga ini.
Temuan penting lainnya adalah adanya kluster spesifik yang menunjukkan karakteristik unik selama proses diferensiasi. Kluster 7, misalnya, menunjukkan ekspresi tinggi penanda kandidat LSC seperti TP63 dan KRT14, serta beberapa faktor transkripsi seperti CXXC5 dan IRF6. Sebaliknya, kluster 5 dan 6 menunjukkan ekspresi gen yang terkait dengan proses proliferasi dan migrasi sel. Perbedaan ekspresi ini mengindikasikan adanya hierarki perkembangan di mana LSCs yang positif TP63 (kluster 7) dapat menghasilkan progeni sel transit amplifying (TACs) yang memiliki kapasitas proliferasi terbatas tetapi penting untuk homeostasis epitel kornea.
Pseudotime trajectory analysis lebih lanjut menunjukkan bahwa ekspresi gen terkait siklus sel seperti CCNB1, CDC20, dan MKI67 mengalami fluktuasi selama proses diferensiasi. Hal ini konsisten dengan temuan bahwa modulasi siklus sel merupakan faktor kunci dalam menentukan nasib sel selama organogenesis. Namun, aktivasi program EMT pada kluster 1 yang menunjukkan karakteristik neural crest menimbulkan tantangan karena sel-sel ini tidak mampu berkembang menjadi LSCs fungsional di bawah kondisi kultur yang digunakan.
Dalam studi ini, penanda molekuler baru yang berpotensi digunakan untuk karakterisasi dan isolasi LSCs juga diidentifikasi. Penanda-penanda tersebut meliputi faktor transkripsi seperti SKIL, serta marker permukaan sel seperti SDC1 dan CD9 yang menunjukkan ekspresi tinggi pada subpopulasi LSCs yang positif TP63. Identifikasi penanda-penanda ini membuka peluang untuk meningkatkan efisiensi diferensiasi LSCs serta memastikan populasi yang lebih homogen untuk aplikasi klinis.
Namun, meskipun studi ini memberikan wawasan yang signifikan, tantangan masih tetap ada. Protokol diferensiasi yang ada perlu dioptimalkan lebih lanjut untuk mengurangi heterogenitas dan meningkatkan efisiensi pembentukan LSCs. Variasi dalam karakteristik lini sel, batch effect, serta perbedaan metode pengujian efisiensi diferensiasi juga menjadi faktor yang mempengaruhi reproduksibilitas hasil. Dengan adanya penanda molekuler baru yang diidentifikasi dalam studi ini, diharapkan tantangan ini dapat diatasi dan aplikasi klinis berbasis LSCs dapat ditingkatkan.
Penelitian ini memberikan kontribusi penting dalam memahami jalur perkembangan dan identitas LSCs yang diturunkan dari hESCs. Dengan pemetaan jalur diferensiasi yang lebih rinci dan identifikasi penanda molekuler baru, diharapkan akan terbuka peluang untuk pengembangan terapi regeneratif yang lebih efektif untuk gangguan permukaan mata.
Sumber:
Sun, C., Wang, H., Ma, Q., Chen, C., Yue, J., Li, B. and Zhang, X., 2021. Time-course single-cell RNA sequencing reveals transcriptional dynamics and heterogeneity of limbal stem cells derived from human pluripotent stem cells. Cell & Bioscience, 11, pp.1-12.
Leave a Reply